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Aug 23, 2023

Eine verzögerte Reifung der Darmmikrobiota im ersten Lebensjahr ist ein Kennzeichen pädiatrischer allergischer Erkrankungen

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 4785 (2023) Diesen Artikel zitieren 115 Altmetric Metrics Details Allergische Krankheiten betreffen Millionen von Menschen weltweit. Ihre Prävalenz hat zugenommen

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 4785 (2023) Diesen Artikel zitieren

115 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Weltweit sind Millionen Menschen von allergischen Erkrankungen betroffen. Ein Anstieg ihrer Prävalenz wurde mit Veränderungen im Darmmikrobiom, also den Mikroorganismen und ihren Genen im Magen-Darm-Trakt, in Verbindung gebracht. Die Reifung des kindlichen Immunsystems und der Darmmikrobiota erfolgt parallel; Daher kann die Konformation des Mikrobioms bestimmen, ob beim Säugling eine tolerante Immunprogrammierung auftritt. Hier zeigen wir anhand tief phänotypisierter Teilnehmer der CHILD-Geburtskohorte (n = 1115), dass es frühe Lebenseinflüsse und Mikrobiommerkmale gibt, die einheitlich mit vier verschiedenen allergischen Diagnosen im Alter von 5 Jahren verbunden sind: atopische Dermatitis (AD, n = 367). ), Asthma (As, n = 165), Nahrungsmittelallergie (FA, n = 136) und allergische Rhinitis (AR, n = 187). In einer Untergruppe mit Shotgun-Metagenom- und Metabolom-Profiling (n = 589) stellen wir fest, dass eine beeinträchtigte 1-Jahres-Reifung der Mikrobiota bei pädiatrischen Allergien universell sein kann (AD p = 0,000014; As p = 0,0073; FA p = 0,00083; und AR p =). 0,0021). Darüber hinaus stellen wir fest, dass eine Reihe grundlegender funktioneller und metabolischer Ungleichgewichte, die durch beeinträchtigte Schleimintegrität, erhöhte oxidative Aktivität, verringerte Nachgärung und erhöhte Spurenamine gekennzeichnet sind, ein wesentlicher Vermittler zwischen der Reifung der Mikrobiota im Alter von 1 Jahr und allergischen Diagnosen im Alter von 5 Jahren sind Jahre (βindirekt = −2,28; p = 0,0020). Die Reifung der Mikrobiota stellt daher einen Schwerpunkt dar, um Abweichungen von der normativen Entwicklung zu identifizieren und so allergische Erkrankungen vorherzusagen und zu verhindern.

Weltweit sind Hunderte Millionen Kinder von allergischen Erkrankungen betroffen, deren Prävalenz weiter zunimmt1,2,3,4. Diese steigenden Raten fielen mit sozialen und ökologischen Veränderungen zusammen, die generationsübergreifende Auswirkungen auf die sich stabil ansiedelnden Mikroben und ihre kollektiven Gene hatten, die unsere Mikrobiota bzw. unser Mikrobiom bilden5,6.

Die im Säuglingsalter entstehende Mikrobiota reagiert in ihrer anfänglichen Ausdehnung und Schwankung besonders empfindlich auf äußere Einflüsse, bevor sie eine stabilere Gemeinschaft erreicht. Tatsächlich beeinflussen viele Risikofaktoren für allergische Erkrankungen, darunter Art der Entbindung, Ernährung, Leben in der Stadt und Antibiotika-Exposition, auch die frühe Zusammensetzung und Struktur der Mikrobiota7,8,9,10. Während dieser Reifungsprozess normalerweise mit der Entwicklung einer gesunden Immuntoleranz einhergeht, kann bei einigen Kindern im gleichen Zeitraum, in dem sich die Mikrobiota etabliert, eine allergische Sensibilisierung auftreten4,11. Angesichts der Beziehung zwischen externen Risikofaktoren, der Reifung des Säuglingsmikrobioms und der pädiatrischen Immunentwicklung hat die Untersuchung des frühen Mikrobioms das Potenzial, prädiktive und therapeutische Strategien zur Verhinderung der Entwicklung allergischer Erkrankungen zu ermöglichen.

Obwohl Asthma, allergische Rhinitis (oder Heuschnupfen), Nahrungsmittelallergie und atopische Dermatitis (oder Ekzeme) oft isoliert als unterschiedliche, organspezifische klinische Diagnosen untersucht werden, können sie viele gemeinsame ätiologische Mechanismen aufweisen, die durch abweichende Typ-2-Entzündungsreaktionen gekennzeichnet sind und erhöhtes IgE11,12,13,14,15. Als Beleg für ihren gemeinsamen biologischen Ursprung wurde eine vorhersehbare Reihe von Erscheinungen dieser Störungen bei Kleinkindern beobachtet, die zusammenfassend als „Allergischer März“ bezeichnet werden11,15. Angesichts dieser Erkenntnisse ist es schwierig, die umweltbedingten und biologischen Grundlagen einzelner allergischer Erkrankungen zu entschlüsseln, und ein kollektiver Ansatz, der alle vier dieser häufigen allergischen Erkrankungen bei Kindern parallel untersucht, wird immer wichtiger. Frühere Studien, die sich mit mehreren Krankheiten befassten, haben gemeinsame Mikrobiom-Assoziationen bei Personen festgestellt, bei denen unterschiedliche individuelle allergische Erkrankungen diagnostiziert wurden16,17. Diese Studien haben einen starken Präzedenzfall für die Identifizierung gemeinsamer signifikanter mikrobieller Merkmale bei Personen geschaffen, die derzeit an Krankheiten leiden. Bisher haben sich nur wenige Studien mit mikrobiellen Zusammenhängen bei Säuglingen mit mehreren unterschiedlichen Folgen allergischer Erkrankungen befasst, und den meisten fehlte die Aussagekraft des prospektiven Längsschnittdesigns der CHILD-Kohorte18.

In dieser Studie haben wir vier klinisch unterschiedliche allergische Erkrankungen untersucht, die im Alter von 5 Jahren in der großen, tief charakterisierten CHILD-Kohortenstudie diagnostiziert wurden. Wir verwendeten einen Multi-Omics-Ansatz, um ein Profil des Stuhls von Säuglingen zu erstellen, der bei Studienbesuchen im Alter von 3 Monaten und 1 Jahr gesammelt wurde. Wir fanden heraus, dass die verzögerte Reifung der Mikrobiota bei Säuglingen bei allen 5-Jahres-Allergiediagnosen im Vergleich zu denen ohne Vorgeschichte einer allergischen Sensibilisierung gleich war und dass diese Verzögerung der Mikrobiota-Reifung der Diagnose einer allergischen Erkrankung vorausging. Bei jeder Diagnose wurden auch funktionelle Auswirkungen dieser Beeinträchtigung beobachtet, darunter eine beeinträchtigte Auswirkung auf die Schleimhautintegrität, ein erhöhtes Oxidationspotential, eine verringerte Nachgärung und Butyratproduktion sowie ein erhöhter Anteil biogener Amine im Darm des Säuglings. Unsere Ergebnisse identifizieren gemeinsame Wirts-Mikrobiom-Mechanismen, die mit der Entwicklung mehrerer klinisch unterschiedlicher allergischer Erkrankungen verbunden sind. Die Priorisierung präventiver Strategien und therapeutischer Interventionen zur Modifizierung dieser Wirt-Mikroben-Interaktionen im Säuglingsalter kann dauerhafte Vorteile bei der Vorbeugung von allergischen Erkrankungen bei Kindern haben, die oft ein Leben lang anhalten.

Der longitudinale und umfassende Charakter der CHILD-Studie bot eine hervorragende Gelegenheit, jede Vorgeschichte einer allergischen Sensibilisierung und die aktuelle Diagnose von Asthma, Nahrungsmittelallergie, atopischer Dermatitis und/oder allergischer Rhinitis klar zu definieren (Abb. 1a). Um falsche Assoziationen aufgrund gleichzeitig auftretender oder vorübergehender allergischer Erkrankungen zu vermeiden, haben wir nur klinische Bewertungen von Teilnehmern einbezogen, die bei jedem Studienbesuch von der Geburt bis zum Alter von 5 Jahren umfassende und vollständige klinische Bewertungen hatten (n = 1115) (Abb. 1a und Ergänzungstabelle). 1). Die streng definierte „gesunde“ Kontrollgruppe umfasste 523 Kinder, die zu keinem Zeitpunkt ihres Lebens Anzeichen einer allergischen Sensibilisierung aufwiesen (definiert als wiederholt negative Allergen-Haut-Pricktests (SPT), keine Vorgeschichte von Keuchen und keine Diagnose einer Allergie Erkrankungen – atopische Dermatitis, Asthma, allergische Rhinitis, Nahrungsmittelallergie), wie durch drei separate klinische Bewertungen im Alter von 1, 3 und 5 Jahren ermittelt (Abb. 1b). Im Vergleich dazu wurden bei 592 Kindern von einem erfahrenen Arzt bei dem alle fünf Jahre geplanten Besuch eine oder mehrere allergische Erkrankungen (z. B. atopische Dermatitis, Asthma, allergische Rhinitis und Nahrungsmittelallergie) diagnostiziert, wobei die Mehrzahl dieser Diagnosen (59,4– 91,2 %) trat gleichzeitig mit einem positiven Haut-Prick-Test (SPT) bei einer oder mehreren der allergischen Untersuchungen auf (ergänzende Abbildung 1a, b).

a Zeitleiste der Einschreibung von KINDERN und der klinischen Bewertungen von der Schwangerschaft bis zu den 5-Jahres-Bewertungen. b Consort-Diagramm der CHILD-Teilnehmer und Proben, die in diese Studie einbezogen wurden, einschließlich der Zusammensetzung der allergischen Erkrankungen der Teilnehmer und der damit verbundenen Diagnosen. Erstellt mit Biorender.com.

Als wir den Zusammenhang von frühen Lebensfaktoren mit der Diagnose einer allergischen Erkrankung im Alter von 5 Jahren mithilfe einer multivariaten bedingten logistischen Regression mit dem Studienort als Strata bewerteten, kamen die folgenden Risikofaktoren zum Vorschein: männliches Geschlecht (angepasstes Odds Ratio (aOR): 1,84). [95 % KI 1,36, 2,49]; p = 6,8e-05), Vorgeschichte väterlicher (aOR: 1,56 [95 % KI 1,13, 2,15]; p = 0,007) oder mütterlicher (aOR: 1,56 [95 % KI 1,14, 2,12). ]; p = 0,0054) Atopie und Antibiotikagebrauch vor dem 1. Lebensjahr (aOR: 2,25 [95 %-KI 1,55, 3,27]; p = 2,0e-05) (Abb. 2a und Ergänzungstabelle 2). Im Gegensatz dazu alle, die bis zum Alter von 6 Monaten stillen (aOR: 0,66 [95 %-KI 0,45, 0,99]; p = 0,043) und sich selbst als Kaukasierin identifizieren (aOR: 0,44 [95 %-KI 0,32, 0,61]; p = 5,1e). -07) waren negativ mit einer Allergiediagnose assoziiert (Abb. 2a und Ergänzungstabelle 2). Insbesondere die erhebliche Überschneidung zwischen diesen damit verbundenen Risikofaktoren und der Diagnose einzelner allergischer Erkrankungen unterstützt unseren gemeinsamen Ansatz zur Identifizierung einer gemeinsamen Ätiologie innerhalb des Säuglingsmikrobioms (Abb. 2b und ergänzende Daten 1).

Multivariable bedingte logistische Regression unter Verwendung der Datenerfassungsstelle als Stratum und Bewertung des Wahrscheinlichkeitsverhältnisses für die Entwicklung einer oder mehrerer atopischer oder allergischer Diagnosen (n = 592) und b einer oder mehrerer atopischer oder allergischer Diagnosen (1+, n = 592). , zwei oder mehr Diagnosen (2+, n = 107) und jeweils atopische Dermatitis (AD, n = 282), Nahrungsmittelallergie (FA, n = 100), Asthma (As, n = 127) oder allergische Rhinitis (AR, n = 141) unter Berücksichtigung frühkindlicher und familiärer Expositionen. (*) p < 0,05, (.) p < 0,1. Für Waldparzellen wurden die Daten als angepasste Quotenverhältnisse (95 %-Konfidenzintervalle) und genaue p-Werte dargestellt: männlich p = 6,8e-05, Antibiotikaverbrauch p = 2,0e-05 und ethnische Zugehörigkeit p = 5,1e-07.

Als nächstes bewerteten wir die Säuglingsstuhl-Mikrobiome der Teilnehmer (n = 589 Teilnehmer), die bei klinischen Untersuchungen für dreimonatige und einjährige Besuche gesammelt und mittels metagenomischer Shotgun-Sequenzierung 19 quantifiziert wurden (Abb. 1b und Ergänzungstabelle 1). Beim Vergleich der Alpha-Diversität innerhalb des Säuglingsmikrobioms zu beiden Zeitpunkten aller einzelnen Allergiediagnosen im Alter von 5 Jahren stellten wir einen signifikanten Rückgang der Shannon-Diversität im Alter von 1 Jahr bei Säuglingen fest, bei denen im Alter von 5 Jahren eine allergische Diagnose gestellt wurde (Abb . 3a, b). Eine zunehmende Diversifizierung ist ein Kennzeichen der Dynamik des Darmmikrobioms von Säuglingen im ersten Lebensjahr und geht mit erheblichen Veränderungen in der Mikrobenhäufigkeit einher7,20,21,22. Dieser Prozess ist so eng mit der frühen Lebensentwicklung verbunden, dass allein die Zusammensetzung der Mikrobiota des Säuglings das chronologische Alter eines Säuglings genau vorhersagen kann23. Um zu verstehen, ob die Reifung der Mikrobiota bei Säuglingen allgegenwärtig mit allergischen Diagnosen im schulpflichtigen Alter verbunden ist, haben wir ein verschachteltes, kreuzvalidiertes, von Mikrobiota abgeleitetes vorhergesagtes Alter unter Verwendung der Artenhäufigkeit im ersten Lebensjahr berechnet (Abb. 3c; Pearson R = 0,89, p < 2.2e-16). Anschließend verglichen wir das von der Mikrobiota abgeleitete Alter für jede der vier allergischen Diagnosen nach 5 Jahren (Abb. 3d). Säuglinge, bei denen zu keinem Zeitpunkt zwischen der Geburt und dem fünften Lebensjahr eine allergische Vorgeschichte festgestellt wurde, hatten bei ihrem einjährigen Besuch ein durchschnittliches mikrobiota-vorhergesagtes Alter von 11,53 (SD 1,32) Monaten. Im Gegensatz dazu hatte jede der vier allergischen Diagnosen im Alter von 5 Jahren trotz des gleichen chronologischen Alters ein statistisch niedrigeres vorhergesagtes Mikrobiota-Alter (atopische Dermatitis p = 0,000014; Asthma p = 0,0073; Nahrungsmittelallergie p = 0,00083; und allergische Rhinitis p =). 0,0021; Abb. 3d, e). Bemerkenswert ist, dass diese Verringerung des durch Mikrobiota vorhergesagten Alters nach einem Jahr bei Kindern mit einer 5-Jahres-Allergiediagnose festgestellt wurde, unabhängig von der SPT-Reaktionsgeschichte (ergänzende Abbildung 1c). Während bei einer Reihe von Kindern im Alter von 5 Jahren mehrere Allergiediagnosen gestellt wurden, war das vorhergesagte Alter sogar bei Kindern mit einer einzigen Allergiediagnose deutlich niedriger (ergänzende Abbildung 1d). Darüber hinaus blieb das durch die Mikrobiota vorhergesagte Alter schützend, wenn man Störvariablen berücksichtigte (aOR einer oder mehrerer allergischer Diagnosen für einen IQR-Anstieg des durch die Mikrobiota vorhergesagten Alters: 0,75 [95 %-KI 0,59, 0,94]; p = 0,010) (Ergänzende Abbildung 2). ). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass eine verminderte Reifung der Mikrobiota im Alter von 1 Jahr mit einem erhöhten Risiko für die Diagnose einer allergischen Erkrankung im Alter von 5 Jahren verbunden ist, unabhängig von der spezifischen allergischen Erkrankung.

Shannon-Diversitätsindex einer 3-Monats-Probe für eine oder mehrere atopische oder allergische Diagnosen (1+, n = 344), zwei oder mehr allergische Diagnosen (2+, n = 130) und einzelne klinische Diagnosen nach 5 Jahren, d. h. atopische Dermatitis (AD, n = 211), Nahrungsmittelallergie (FA, n = 73), Asthma (As, n = 100) oder allergische Rhinitis (AR, n = 108) nach 5 Jahren und eine gesunde Kontrollgruppe (HC, n = 244) Teilnehmer sowie b 1-Jahres-Stichproben für 1+ (n = 353, p = 0,039), 2+ (n = 82) und einzelne klinische Diagnosen nach 5 Jahren, d. h. AD (n = 212). , p = 0,021), FA (n = 75, p = 0,043), As (An = 103, p = 0,0097) oder AR (n = 113), nach 5 Jahren, und HC (n = 236) Teilnehmer, c Streudiagramm zwischen chronologischem Alter und vom Mikrobiom abgeleitetem Alter mit linearer Regressionslinie der besten Anpassung (Pearson R = 0,89, p < 2,2e-16). d Voraussichtliches Alter und chronologisches Alter für aggregierte und individuelle klinische Diagnosen im Vergleich zu keiner Diagnose nach 5 Jahren. e Vorhergesagtes Alter von 1-Jahres-Proben für 1+ (n = 353, p = 0,000036), 2+ (n = 82, p = 0,0023) und individuelle klinische Diagnosen nach 5 Jahren, d. h. AD (n = 212, p = 0,000014), FA (n = 75, p = 0,00083), As (n = 103, p = 0,0073) oder AR (n = 113, p = 0,0021) nach 5 Jahren und HC (n = 236) Teilnehmer . Die P-Werte stammen aus Wilcoxon-Tests zwischen HC und jeder allergischen Diagnose (b, c, e). Bei Boxplots werden die Daten als Boxplots dargestellt (Mittellinie beim Median, obere Grenze beim 75. Perzentil, untere Grenze beim 25. Perzentil) mit Whiskers bei den Minimal- und Maximalwerten. (*) p < 0,05.

Angesichts der Tatsache, dass eine Beeinträchtigung der Reifung der Mikrobiota nach 1 Jahr bei allen einzelnen allergischen Diagnosen nach 5 Jahren vorlag, analysierten wir die zugrunde liegenden taxonomischen und funktionellen Komponenten, die mit dem von der Mikrobiota vorhergesagten Alter und deren Zusammenhang mit der Allergieentwicklung verbunden sind. Wir haben uns zunächst auf die 25 besten Arten mit der höchsten durchschnittlichen Wichtigkeitsbewertung basierend auf dem verschachtelten, kreuzvalidierten Zufallswaldmodell konzentriert und ihre direktionale Auswirkung auf das vorhergesagte Alter mithilfe eines linearen Mischeffektmodells mit Altersanpassung und einem Zufallseffekt der Stichprobe verglichen Sammelstelle (Abb. 4a). Als wir die Artenhäufigkeit innerhalb der 1-Jahres-Mikrobiota zwischen Kindern verglichen, bei denen nach 5 Jahren eine allergische Diagnose gestellt wurde oder nicht, identifizierten wir 9 überlappende Arten, die mit dem von der Mikrobiota abgeleiteten vorhergesagten Alter in Zusammenhang standen und eine unterschiedliche Häufigkeit aufwiesen (Falschentdeckungsrate ( FDR) <0,1) bei Säuglingen, bei denen später allergische Erkrankungen diagnostiziert wurden (Abb. 4b und ergänzende Abb. 3). Dazu zählten Rückgänge bei Anaerostipes hadrus, Fusicatenibacter saccharivorans, Eubacterium hallii und Blautia wexlerae sowie Anstiege bei Eggerthella lenta, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Clostridium innocuum und Tyzzerella nexilis bei Säuglingen, bei denen im Alter von 5 Jahren eine allergische Diagnose gestellt wurde (Abb. 4c). Dieses Muster, das die Bedeutung einer Kerngruppe von Arten hervorhebt, wurde im Allgemeinen in Analysen einzelner allergischer Erkrankungen wiederholt (Abb. 4c). In diesen Proben stellten wir außerdem einen Zusammenhang zwischen erhöhtem C. innocuum und T. nexilis und dem Einsatz von Antibiotika, veränderten C. innocuum, E. lenta, E. faecalis und T. nexilis und dem Stillstatus nach 6 Monaten sowie unterschiedlichen C. innocuum und E . lenta bis zur väterlichen Atopie, wobei einige der Umwelteinflüsse und klinischen Einflüsse identifiziert werden, die möglicherweise das Mikrobiom prägen (Ergänzungstabelle 3). Zusätzlich zu einer veränderten Diversifizierung weisen daher Veränderungen in der Häufigkeit einer Kerngruppe von Arten sowohl auf eine verringerte Reifung der Darmmikrobiota bei Säuglingen als auch auf die Entwicklung mehrerer klinisch unterschiedlicher allergischer Erkrankungen hin.

a Die 25 wichtigsten Arten bei der Bestimmung des vorhergesagten Alters, schattiert gemäß dem MaAsLin2-Regressionskoeffizienten mit vorhergesagtem Alter, angepasstem chronologischem Alter und mit einem zufälligen Effekt der Probenentnahmestelle. Die Größe der Punkte stellt die logarithmische relative Häufigkeit dar. b Venn-Diagramm der 25 wichtigsten Arten im vorhergesagten Alter und Unterschied innerhalb der atopischen Erkrankung im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen. c Die neun häufig identifizierten Arten innerhalb einer oder mehrerer atopischer oder allergischer Diagnosen (1+, n = 353), zwei oder mehr allergischer Diagnosen (2+, n = 82) und einzelnen klinischen Diagnosen nach 5 Jahren, d. h. atopische Dermatitis ( AD, n = 212), Nahrungsmittelallergie (FA, n = 75), Asthma (As, n = 103) oder allergische Rhinitis (AR, n = 113) nach 5 Jahren im Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe (HC, n = 236) Teilnehmer, angepasst an das chronologische Alter zum Zeitpunkt der Entnahme und mit einem zufälligen Effekt der Probenentnahmestelle. Die Daten wurden als MaAslin2-Koeffizienten ± Standardfehler dargestellt.

Die Definition der funktionellen Auswirkungen einer verminderten Reifung der Darmmikrobiota bei Säuglingen könnte wichtige Wege aufdecken, die gezielt eingesetzt werden könnten, um die Entwicklung einer anhaltenden allergischen Erkrankung zu verhindern. Dies veranlasste uns, zwei multivariate Mixed-Effect-Regressionen der 347 MetaCyc-Pfade mit einer Prävalenz von mindestens 10 % unter Berücksichtigung des chronologischen Alters und unter Verwendung der Sammelstelle als Zufallseffekt unter Verwendung der etablierten 5-Jahres-Allergiediagnosegruppen und aus Mikrobiota abgeleitet durchzuführen prognostiziertes Alter als jeweiliges Ergebnis in jeder Analyse (Abb. 5a). Wir identifizierten 193 Signalwege, die signifikant mit mindestens einer der zusammengesetzten oder individuellen 5-Jahres-Allergiediagnosen assoziiert sind, und 281 Signalwege, die mit dem vorhergesagten Alter assoziiert sind (FDR <0,1, Zusatzdaten 2). Als wir darüber hinaus die MetaCyc-Signalweghäufigkeit zwischen gesunden Kindern und solchen mit einer 5-Jahres-Allergiediagnose verglichen, waren 171 der 193 signifikant veränderten Signalwege in Allergikergruppen auch mit dem vorhergesagten Alter verbunden (Supplementary Data 2).

ein MaAslin2-Vulkandiagramm von Metacyc-annotierten Genpfaden unter Verwendung des vorhergesagten Alters als Ergebnis, angepasst an das chronologische Alter und einen zufälligen Effekt der Probenentnahmestelle. b 11 Signalwege, die mit dem vorhergesagten Alter und der Differenzierung innerhalb von vier oder mehr Differenzialanalysen zu atopischen Erkrankungen verbunden sind (einzeln oder aggregiert; FDR < 0,1). c Heatmap der Spearman-Korrelationsanalyse zwischen 11 interessierenden Pfaden und neun in Abb. 4 identifizierten Arten.

Während wir bei allen vier Allergiediagnosen ähnliche Muster sahen, unterschieden sich 11 Signalwege signifikant in mindestens zwei der Allergiediagnosen und einer der zusammengesetzten Gruppen, die alle auch signifikant mit dem vorhergesagten Alter assoziiert waren (Abb. 5b und ergänzende Daten). 3). Neun davon standen in negativem Zusammenhang mit dem durch die Mikrobiota vorhergesagten Alter und waren anschließend bei Säuglingen, die Allergien entwickelten, erhöht. Dazu gehören Wege, die dem Schleimabbau über die Reduktion der Cysteindisulfidbindung entsprechen (z. B. Sulfoquinovose-Abbau I und Molybdopterin-Biosynthese24,25,26), eine erhöhte oxidative Atmung (z. B. NAD(P)/NADPH-Umwandlung26) und die Nutzung oxidierter Monosaccharide (z. B. D-Galactarat- und D-Glucarat-Abbau27). Umgekehrt waren zwei Wege positiv mit dem vorhergesagten Alter sowie dem Schutz vor der Entwicklung von Allergien verbunden, einschließlich der Methanogenese durch Acetat- und Schwefeloxidation28,29. Eine Spearman-Korrelationsanalyse ergab einen signifikanten Zusammenhang zwischen B. wexlerae, F. saccharivorans, A. hadrus und E. hallii und Signalwegen mit schützenden Assoziationen, während E. coli hauptsächlich mit Signalwegen korrelierte, die bei Säuglingen im Alter von 5 Jahren erhöht waren Allergiediagnose (Abb. 5c). Daher ist eine verminderte Reifung der Darmmikrobiota bei Säuglingen mit einer weitreichenden funktionellen Dysregulation verbunden, die sich mit der Entwicklung allergischer Störungen überschneidet.

Metaboliten im Darm spielen eine wesentliche Rolle bei der biologischen Wirkung des Mikrobioms auf den Wirt30,31,32,33. Als nächstes versuchten wir zu verstehen, ob die Reifung der Mikrobiota mit dem Darmmetabolom des Säuglings und der anschließenden Allergieentwicklung zusammenhängt. Wir haben gezielte Kernspinresonanz (NMR; 31 Metaboliten) und Flüssigkeitschromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS; 214 Metaboliten) auf eine Teilmenge der Stuhlproben von CHILD-Teilnehmern (n = 509) angewendet, um diesen wichtigen Aspekt der Beiträge zu untersuchen des Mikrobioms auf die Darmumgebung durch die Messung von 245 relevanten Metaboliten (Abb. 1). Um zunächst den Zusammenhang zwischen der Reifung der Mikrobiota und den Stoffwechselprofilen nach einem Jahr zu verstehen, haben wir eine PERMANOVA-Analyse durchgeführt, um den Prozentsatz der Varianz zu quantifizieren, der durch das von der Mikrobiota abgeleitete vorhergesagte Alter erklärt wird, und um die Zeit zwischen Probenentnahme und -lagerung sowie das genaue Alter der Probenentnahme anzupassen. unter Verwendung der Sammelstelle als Schicht. Wir fanden heraus, dass das von der Mikrobiota vorhergesagte Alter die Varianz des 1-Jahres-Metaboloms signifikant erklärte (2,2 % erklärte Varianz, p = 0,00090, F = 15,35) (Abb. 6a). Als nächstes gruppierten wir verwandte Metaboliten mithilfe der gewichteten Korrelationsnetzwerkanalyse (WGCNA) in 14 verschiedene Module (wobei 50 Metaboliten keinem der 14 Module entsprachen) und kartierten ihre Interaktion, um die Stoffwechsellandschaft des Säuglingsdarms nach einem Jahr zu visualisieren (Abb . 6b und ergänzende Abb. 5). Wir identifizierten sieben Module und 27 nicht gruppierte Metaboliten, die 120 der insgesamt 245 Metaboliten darstellen, die signifikant mit dem vorhergesagten Alter assoziiert waren (FDR <0,1, ergänzende Abbildung 5). hängt auch stark mit dem Darmmetabolom des Säuglings zusammen.

ein Diagramm der Hauptkomponentenanalyse (PCA) der Varianz innerhalb des 1-Jahres-Darmmetaboloms und gefärbt durch die vorhergesagte Altersverteilung. b Durch die gewichtete Gen-Koexpressionsanalyse (WGCNA) bestimmte Module und Wechselwirkungen von Metaboliten im 1-Jahres-Darm, kartiert mit Cytoscape. c Spearman-Korrelations-Heatmap der Beziehung zwischen Metaboliten, WGCNA-Clustern und interessierenden Mikrobiommerkmalen, die in den Abbildungen identifiziert wurden. 3, 4. (*) q < 0,05.

Anschließend untersuchten wir die Beziehung zwischen diesen Metabolitenkonzentrationen und den interessierenden Arten und Signalwegen, die wir durch Metagenomik identifiziert hatten (Abb. 6c). Unter den Korrelationen identifizierten wir zehn einzelne Metaboliten und vier Stoffwechselcluster, die in signifikantem Zusammenhang mit wichtigen Signalwegen innerhalb der Darmmikrobiota des Säuglings standen (FDR <0,05). Darüber hinaus identifizierten wir 11 einzelne Metaboliten und sieben Stoffwechselcluster, die signifikant mit der Häufigkeit wichtiger Arten assoziiert waren. Von den wichtigen Funktionswegen korrelierte die Schwefeloxidation mit der größten Anzahl an Stoffwechselmerkmalen (sechs einzelne Metaboliten und zwei Stoffwechselcluster), während E. coli von den wichtigen Mikrobiota mit der größten Anzahl an Stoffwechselmerkmalen korrelierte (fünf einzelne Metaboliten und zwei Stoffwechsel). Cluster). Von den Metaboliten korrelierten Spurenamine (TAs), die aus aromatischen Aminosäuren, Tryptamin, Tyramin und Phenylethylamin stammen, signifikant mit 85 % (17 von 20) der wichtigen Merkmale, sowie Butyrat, eine wichtige kurzkettige Fettsäure für die Immuntoleranz , korreliert mit F. saccharivorans, A. hadrus und Schwefeloxidation.

Ein verzögertes vorhergesagtes Alter ist signifikant mit jeder 5-Jahres-Allergiediagnose sowie einer Dysregulation innerhalb der Funktionsfähigkeit beider Mikrobiome verbunden (z. B. veränderter Schleimabbau, erhöhte oxidative Atmung und Nutzung oxidierter Monosaccharide sowie verminderte Schwefeloxidation und sekundäre Fermentationskapazität) ( Abb. 5) und die Stoffwechsellandschaft des Darms eines einjährigen Säuglings (z. B. erhöhte TAs und verringertes Butyrat) (Abb. 6 und ergänzende Abb. 5). Wir haben daher ein Strukturgleichungsmodell (SEM) entwickelt, um die Hypothese zu testen, dass diese Dysregulation sowohl des genetischen Potenzials als auch der Stoffwechselleistung nach einem Jahr das erhöhte Allergierisiko bei Kindern mit verzögerter Mikrobiota-Reifung verursacht (Abb. 7). Gestörte Signalwege und Metaboliten in der 1-Jahres-Stuhlprobe wurden zu einer latenten Variablen zusammengefasst und ein indirekter Effekt zwischen dem durch die Mikrobiota vorhergesagten Alter und der Diagnose von Allergien nach 5 Jahren quantifiziert. Innerhalb dieses Modells identifizierten wir einen signifikanten indirekten Effekt (p = 0,0020, \(\beta\) = −2,28) für die 1-Jahres-Stuhllatenzvariable, wobei jedes dysregulierte Merkmal zu diesem Effekt beitrug. Daher wird der Zusammenhang zwischen einer beeinträchtigten Reifung der Mikrobiota und Allergien im Alter von 5 Jahren wahrscheinlich durch diese multiomischen Signale vermittelt, wodurch sie an der Spitze der mechanistischen Ziele stehen und das Potenzial haben, die Entwicklung von Allergien gemeinsam vorherzusagen und/oder zu verhindern.

Strukturgleichungsmodellierungsdiagramm (SEM), das die direkten und indirekten Auswirkungen des vorhergesagten Alters auf atopische und allergische Erkrankungen zeigt, vermittelt durch die 1-Jahres-Mikrobiom- und Metabolommerkmale.

Obwohl es einzigartige organspezifische klinische Manifestationen gibt, weist die Wechselbeziehung zwischen allergischen Erkrankungen darauf hin, dass gemeinsame pathophysiologische Mechanismen zu ihrer Entwicklung beitragen11,12,13,14,15. Während viele Studien, die sich auf einzelne allergische Erkrankungen konzentrierten, damit verbundene Veränderungen innerhalb der Mikrobiota identifizierten, fanden wir nur eine andere Studie, die einen aggregierten Ansatz verfolgte16, und keine veröffentlichten Studien, die auch Mikrobiota-Signaturen untersuchten, die vor der allergischen Sensibilisierung existierten. Durch die Kombination einer umfassenden, longitudinalen klinischen Phänotypisierung mit fachärztlichen klinischen Beurteilungen während der ersten fünf Lebensjahre konnten wir die Mikrobiomverschiebungen bei Säuglingen identifizieren, die vor der allergischen Diagnose bestanden. Darüber hinaus lieferte uns dieser Ansatz eine umfassend charakterisierte „gesunde Kontrollgruppe“, bei der bei drei getrennten Besuchen im Alter von 1 bis 5 Jahren keine erkennbaren Anzeichen einer allergischen Sensibilisierung festgestellt wurden. Auf diese Weise konnten wir zeigen, dass unabhängig von der Diagnose ein verringertes Mikrobiota-vorhergesagtes Alter ein Kennzeichen der zukünftigen Allergieentwicklung ist und so einen Schwerpunkt für die Bekämpfung pädiatrischer allergischer Erkrankungen schaffen.

Während frühere Studien eine verringerte Reifung der Mikrobiota mit einer frühen atopischen Sensibilisierung und der Entwicklung von Asthma in Verbindung gebracht haben23,34,35, legt unsere Studie nahe, dass diese beeinträchtigte Reifung für das gesamte Spektrum pädiatrischer allergischer Diagnosen universell sein könnte. Der von uns berichtete Trend zur Reifungsveränderung spiegelt sich in der Abnahme der Bakterienarten A. hadrus, F. saccharivorans, E. hallii und B. wexlerae bei Teilnehmern wider, die später allergische Erkrankungen entwickelten, sowie in der Anreicherung von E. lenta und C. innocuum , E. faecalis, E. coli und T. nexilis bei diesen Teilnehmern. Bei den dezimierten Bakterienpopulationen handelt es sich um bekannte Produzenten kurzkettiger Fettsäuren (SCFA), insbesondere die Butyratproduzenten A. hadrus, E. hallii und F. saccharivorans36,37,38 sowie der Acetatproduzent B. wexlerae39; SCFAs sind Metaboliten, die im Darm klar definierte Wirtsvorteile vermitteln40. Obwohl kein signifikanter Zusammenhang mit einer allergischen Erkrankung an sich besteht, berichten wir über einen Butyratmangel bei zu Allergien neigenden Teilnehmern und signifikante Zusammenhänge zwischen der relativen Häufigkeit und Butyratkonzentration von A. hadrus und F. saccharivorans. Dies bestärkt die Annahme, dass die Produktion von Butyrat und seine Wirkung auf Immunzellen ein Modus ist, durch den eine optimale Immunmodulation im frühen Leben erfolgt. Im Gegensatz dazu wurden Arten, die bei zu Allergien neigenden Teilnehmern angereichert sind, mit pathogener Aktivität und schlechten Gesundheitsergebnissen in Verbindung gebracht41,42,43,44,45, wobei viele dieser Mikrobiommerkmale mit Metaboliten in Zusammenhang stehen, die bei denselben Teilnehmern angereichert sind.

Darüber hinaus erweiterte unsere mechanistische Charakterisierung das bisherige Wissen, um reifungsabhängige Funktionsmerkmale zu ermitteln. Wir berichten über umfassende Veränderungen des funktionellen Potenzials sowohl für das durch die Mikrobiota vorhergesagte Alter als auch für die unabhängigen Überlegungen zu allergischen Diagnosen. Innerhalb des Mikrobioms waren Ungleichgewichte in den Funktionswegen, die auf eine Dysbiose hinweisen, mit einem verringerten vorhergesagten Alter und einem erhöhten Allergierisiko verbunden. Dazu gehörten ein Zusammenbruch der Schleimhautintegrität durch erhöhte Schwefelreduktion und verringerte Schwefeloxidationswege46, erhöhte Oxidationsniveaus und die daraus resultierende Verfügbarkeit oxidierter Monosaccharide27,47 sowie ein verringertes Potenzial für eine Nachgärung48. Die Ergebnisse unserer Shotgun-Metagenomsequenzierung wurden durch eine gezielte Stoffwechselprofilierung in denselben Stuhlproben von Säuglingen ergänzt. Zusätzlich zu einem hohen Grad an Konnektivität zwischen der Reifung der Mikrobiota und der Funktionalität des Mikrobioms entdeckten wir einen starken Zusammenhang zwischen dem von der Mikrobiota abgeleiteten Alter und der Stoffwechsellandschaft des Stuhls. Tatsächlich waren von den 245 untersuchten Metaboliten 27 der 50 (54 %) Cluster-unabhängigen Metaboliten und 7 der 14 (50 %) Metaboliten-Cluster signifikant mit dem von der Mikrobiota vorhergesagten Alter assoziiert. Mehrere reifungsabhängige Metaboliten waren bei Kindern, die Allergien gegen drei biogene Amine entwickelten, nämlich Phenylethylamin, Tryptamin und Tyramin, gestört, was ebenfalls eine hohe Korrelation mit gestörten mikrobiellen Signalwegen zeigte. Spurenamine (TAs) Phenylethylamin, Tryptamin und Tyramin kommen typischerweise in geringen Mengen vor und haben im Vergleich zu anderen biogenen Aminen deutliche biologische Auswirkungen. Tatsächlich haben TAs eine sehr hohe Affinität zu TA-assoziierten Rezeptoren (TAARs), einer Klasse von G-gekoppelten Proteinrezeptoren, die sowohl auf Darm- als auch auf Immunzellen vorkommen, und es wurde gezeigt, dass die TAAR-Ligation den oxidativen Stress der Darmzellen und die Aktivierung der Immunzellen erhöht49, 50. Darüber hinaus fördert ihre Anreicherung die Anhaftung von Bakterien an Darmzellen, wodurch diese Entzündungsreaktion wahrscheinlich aufrechterhalten wird51,52. Auf diese Weise könnte die mikrobiotaabhängige Begrenzung der TA-Häufigkeit ein unterschätzter Mechanismus zur Förderung der tolerogenen Immunentwicklung im Säuglingsalter sein.

Im Rahmen dieser Studie erkennen wir ausdrücklich an, dass wir über epidemiologische Zusammenhänge berichten und dass unsere streng ausgewählte Kohorte (n = 1115) nicht vollständig die gesamte CHILD-Kohorte repräsentiert (z. B. berichten wir über einen etwas höheren Anteil an Teilnehmern mit familiärer Vorgeschichte von Atopie und Vorgeschichte). des Stillens als die größere Kohorte) (Ergänzungstabelle 1). Darüber hinaus handelt es sich bei CHILD um eine prospektive Beobachtungskohorte, und es sind zusätzliche Studien unabhängiger Kohorten erforderlich, um unsere Ergebnisse zu untermauern, wie dies bei den meisten mikrobiombasierten Studien der Fall ist. Dies ist in erster Linie auf die natürliche Varianz zurückzuführen, die innerhalb und zwischen den Stichproben besteht. Beispielsweise kann sich die Biogeographie innerhalb von Stuhlproben auf die Zusammensetzung der Mikrobiota auswirken, und obwohl Stuhlaliquots vor unseren metagenomischen und metabolomischen Analysen homogenisiert wurden, kann es zu Abweichungen zwischen einzelnen Aliquots kommen, die aus demselben Stuhl entnommen wurden. Die Varianz spiegelt sich auch zwischen den Proben wider (z. B. kann sich die Zusammensetzung des Stuhls von Säuglingen je nach Tag unterscheiden, und Säuglinge verschiedener Populationen weisen häufig eine unterschiedliche Mikrobiota-Zusammensetzung auf). Obwohl unsere Ergebnisse vielversprechend sind und in einer großen, kanadaübergreifenden Kohorte beobachtet wurden, wird die Replikation innerhalb anderer leistungsstarker Kohorten für die Validierung dieser Ergebnisse wichtig sein.

Obwohl wir über einen möglichen Mechanismus zur mikrobiotaabhängigen Unterstützung der tolerogenen Immunentwicklung durch die Wechselwirkung der erhöhten TAs Tryptamin, Tyramin und Phenylethylamin sowie abgereichertes Butyrat mit Darm- und Immunzellrezeptoren bei Säuglingen berichten, bei denen später eine allergische Erkrankung diagnostiziert wurde, sind zukünftige Studien erforderlich Durchführung mechanistischer In-vitro- und In-vivo-Studien in Zell- und Mausmodellen, um Einblicke in die Kausalität zu gewinnen. Dies gilt insbesondere für das Vorhandensein von Metaboliten in den Stuhlproben der Teilnehmer und deren Zuordnung zu bestimmten Mikrobenspezies und/oder Funktionswegen, da wir nur Korrelationen zwischen Metaboliten und Stoffwechselwegen identifizieren konnten. Mechanistische Studien, mit denen artspezifische enzymatische Beziehungen zu diesen Metaboliten getestet werden können, würden unser Verständnis ihrer Beziehung zur Reifung der Mikrobiota und zu allergischen Erkrankungen erheblich verbessern.

Obwohl wir die ähnlichen klinischen und mikrobiellen Signale hervorgehoben haben, die allergischen Erkrankungen zugrunde liegen, liefert die Identifizierung einzigartiger Merkmale, die mit einzelnen Krankheiten sowie atopischen und nicht-atopischen Manifestationen verbunden sind, wertvolle Einblicke in die Differenzierung ihrer biologischen Grundlagen, und weitere Arbeiten in diesem Studienbereich sind erforderlich. Studien, die sich genauer mit klinischen und umweltbedingten Variablen befassen, die mit der Reifung der Mikrobiota und der Entwicklung von Allergien zusammenhängen, wären daher von Vorteil.

Insgesamt verglichen wir mithilfe einer umfassenden klinischen Phänotypisierung, einschließlich wiederholter Tests und standardisierter ärztlicher Diagnosen, 1115 Kinder mit Asthma, allergischer Rhinitis, Nahrungsmittelallergie oder atopischer Dermatitis mit einer streng definierten, nicht allergischen Vergleichsgruppe. Anschließend nutzten wir einen Multi-Omics-Ansatz bei 589 dieser Kinder, der die metagenomische Shotgun-Sequenzierung und die metabolomischen Profile ihres Säuglingsmikrobioms umfasste, und stellten fest, dass eine beeinträchtigte Reifung der Säuglingsmikrobiota für die Entwicklung aller pädiatrischen Allergien universell sein kann. Wir haben die detaillierten Grundlagen für diesen Rückgang der Reifung des Darmmikrobioms beschrieben, die in der Veränderung einer Kerngruppe von Arten und funktionellen Signalwegen (z. B. möglicher Zusammenbruch der Integrität der Darmschleimhaut, erhöhte Werte für oxidativen Stress und anschließend oxidierte Monosaccharide sowie verminderte Nachgärung) liegen. und metabolisches Ungleichgewicht (dh erhöhte TAs), das mit einem verringerten Reifealter der Mikrobiota und einem erhöhten Allergierisiko verbunden ist. Zusammenfassend liefert diese Studie Einblicke in unterschätzte und nuancierte Aspekte des Säuglingsmikrobioms, die eine verbesserte Prävention und Vorhersage allergischer Erkrankungen ermöglichen werden.

Diese Forschung entspricht allen relevanten ethischen Vorschriften und wurde von der University of British Columbia, der University of Manitoba, der University of Toronto, der McMaster University, dem BC Children's Hospital, dem Hospital for Sick Children und der Simon Fraser University verfasst und genehmigt. Die Nummer des Research Ethics Board lautet H07-03120. Das Board of Record (wie oben erwähnt) hat diese Studie gemäß den Anforderungen des Tri-Council Policy Statement: Ethical Conduct for Research Involving Humans (TCPS2, 2018) geprüft und genehmigt. Das „Board of Record“ ist das Forschungsethikgremium, das von den teilnehmenden REBs, die an einer harmonisierten Studie beteiligt sind, delegiert wird, um den Ethikprüfungs- und Genehmigungsprozess zu erleichtern.

Bei der CHILD-Studie handelt es sich um eine multizentrische, prospektive, longitudinale, allgemeine Geburtskohortenstudie zur Beobachtung von Säuglingen von der Schwangerschaft bis zum Alter von 5 Jahren und darüber hinaus. Die Einschreibung begann im Jahr 2008 und endete im Jahr 2012. Insgesamt haben sich 3621 schwangere Frauen aus vier Städten (Vancouver, Edmonton, Winnipeg, Toronto) in ganz Kanada eingeschrieben, zusammen mit berechtigten Säuglingen (n = 3455), die keine angeborenen Anomalien aufwiesen und bei einem Jahr geboren wurden mindestens 34 Schwangerschaftswochen53. Zum Zeitpunkt dieser Studie wurde die Einverständniserklärung der Eltern eingeholt. KINDER Studienkinder wurden prospektiv beobachtet und detaillierte Informationen zu Umweltexpositionen sowie klinischen Messungen und Bewertungen wurden mithilfe einer Kombination aus Fragebögen und persönlichen klinischen Bewertungen gesammelt. Kurz gesagt, die Fragebögen wurden bei der Rekrutierung, in der 36. Schwangerschaftswoche, im Alter von 3, 6, 12, 18, 24, 30 Monaten und im Alter von 3, 4 und 5 Jahren ausgefüllt; Es wurden Daten zu Umweltbelastungen und zur allgemeinen Gesundheit erhoben. Darüber hinaus wurden im Alter von 1, 3 und 5 Jahren von den Eltern Fragebögen ausgefüllt, die im Rahmen der International Study of Asthma and Allergies in Childhood (ISAAC)54 validiert wurden.

Allen Säuglingen, die in das CHILD-Protokoll aufgenommen wurden, wurde bei ihren geplanten Besuchen im Alter von 1, 3 und 5 Jahren eine SPT verabreicht. Anschließend wurde bei den Kindern eine IgE-vermittelte allergische Sensibilisierung (auch als Atopie bezeichnet) diagnostiziert, basierend auf Haut-Prick-Tests (SPT) auf mehrere gängige Nahrungsmittel und inhalative Umweltallergene, wobei eine durchschnittliche Quaddelgröße von 2 mm als positives Ergebnis verwendet wurde Test relativ zur Negativkontrolle. Zu den Allergenen, die bei allen 1-, 3- und 5-Jahres-Besuchen getestet wurden, gehören Katzenhaare, die Deutsche Schabe, Alternaria tenuis, Hausstaubmilben (Dermatophagoides psteronyssinus und Dermatophagoides farnae), Hundeepithel, Kuhmilch, Erdnüsse, Eiweiß usw Sojabohne. Darüber hinaus wurden Teilnehmer bei drei- und fünfjährigen Besuchen mit Cladosporium, Penicillium, Aspergillus fumigatus, Bäumen, Gras, Unkraut und Ambrosia getestet. Glycerin und Histamin dienten als Negativ- bzw. Positivkontrolle.

Die primären Ergebnisse unserer Studie waren atopische Dermatitis, Asthma, Nahrungsmittelallergien und allergische Rhinitis, die von einem erfahrenen Studienarzt bei der klinischen Beurteilung anhand der Anamnese und der körperlichen Untersuchung in Kombination mit einem Pricktest diagnostiziert wurden (als „Ja/Möglich/Nein“) das Alter von 5 Jahren basierend auf unserem veröffentlichten Ansatz55. Für diese Studie wurde bei Kindern nur dann davon ausgegangen, dass sie an allergischen Erkrankungen litten, wenn die Antwort auf eine klinische Untersuchung, ob sie atopische Dermatitis, Asthma, Nahrungsmittelallergie und/oder allergische Rhinitis hatten, mit „Ja“ lautete. Nicht-allergische Kontrollen beschränkten sich auf Kinder mit „Nein“-Antworten bei 5-Jahres-Diagnosen, negativen Allergen-SPTs nach 1, 3 und 5 Jahren und ohne Vorgeschichte von pfeifenden Atemgeräuschen nach 1, 3 und 5 Jahren. Im Rahmen der aktuellen Studie analysierten wir die Daten in einer Teilmenge von CHILD, die Daten für Eltern- und Kinderfragebögen, SPT-Ergebnisse und Arztdiagnosen nach 5 Jahren für Fälle und nach 1, 3 und 5 Jahren für Kontrollen enthielt (n = 1115, Abb . 1b und Ergänzungstabelle 1).

Die Probenentnahme und Sequenzierung erfolgte wie zuvor in den Referenzen beschrieben. 19,53. Konkret wurden Stuhlproben aus Windeln bei einem Hausbesuch nach etwa 3 Monaten [Mittelwert (SD), 3,8 (1,1) Monate] und bei einem Klinikbesuch nach etwa einem Jahr [Mittelwert (SD), 12,5 (1,6) Monate] entnommen. Die Proben wurden kurz bei 4 °C gelagert und dann mit einem entpyrogenisierten Edelstahlspatel in vier 2-ml-Kryoröhrchen aliquotiert und bei –80 °C eingefroren. CHILD zeichnete die Zeit zwischen der Stuhlsammlung und der Langzeitlagerung auf und diese Verarbeitungszeit wurde in unserer statistischen Analyse der Stoffwechselprofile angepasst.

Daten zur metagenomischen Shotgun-Sequenzierung wurden von Diversigen (Minneapolis, MN, USA) aus Stuhlproben generiert (durchschnittliche Tiefe von 5 Millionen Lesevorgängen pro Probe). Die DNA wurde aus Proben mit dem MO BIO PowerSoil Pro durch Perlenschlagen in 0,1-mm-Glasperlenplatten extrahiert, wobei die hochwertige Eingangs-DNA mit Quant-iT PicoGreen verifiziert wurde. Bibliotheken wurden auf einem Illumina NextSeq mit Single-End-1 × 150-Lesevorgängen vorbereitet und sequenziert. Sequenzen mit geringer Qualität (Q-Score <30) und Länge (<50) wurden entfernt und Adaptersequenzen wurden gekürzt. Host- und Lesevorgänge mit geringer Qualität wurden entfernt und nur Proben mit mindestens 1 Million verbleibenden Lesevorgängen wurden für die nachgelagerte Analyse aufbewahrt.

Die bioBakery 3-Pipeline wurde verwendet, um Sequenzen abzubilden und Sequenzen in taxonomische (Arten- und Stammebene) und funktionelle Merkmale innerhalb jeder Probe zu klassifizieren56. Die bioBakery 3-Pipeline ist Open Source und ihre Funktionalität wurde veröffentlicht56. Konkret wurde MetaPhlAn 3 für die taxonomische Klassifizierung und HUMAnN 3 für die funktionelle Profilerstellung verwendet.

Stoffwechselprofile wurden aus denselben sequenzierten Stuhlproben im Metabolomics Innovation Center (TMIC) in Edmonton, Alberta, unter Verwendung zweier separater Tests erstellt. Eine gezielte Kernspinresonanzanalyse (NMR) von 31 Metaboliten wurde in 62 Chargen durchgeführt57,58. Die gezielte Flüssigkeitschromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS)-Analyse von 590 Metaboliten wurde mithilfe des Microbiome Metabolism (MEGA)-Assays von TMIC über 27 Chargen hinweg durchgeführt59,60. Es wurde bestätigt, dass die NMR- und LC-MS/MS-Präzision einen Variabilitätskoeffizienten (CV) von <5 bzw. <10 % aufweist. Darüber hinaus wurden überlappende Metaboliten, die mit beiden Methoden erkannt wurden, gegengeprüft, um die Genauigkeit der gemeldeten Konzentrationswerte zu bestätigen.

Detaillierte Methoden sowohl für NMR- als auch LC-MS/MS-Analysen finden Sie in den ergänzenden Methoden. Kurz gesagt, jede Analyse wurde mit etwa 100 mg Stuhl durchgeführt. Proben mit geringer Masse oder Windelfasern wurden ausgeschlossen. Der Stuhl wurde vor und nach der Lyophilisierung gewogen, um den Gesamtwassergehalt vor der Analyse zu quantifizieren. Die Analytkonzentrationen wurden mithilfe eines Standardansatzes zur absoluten Quantifizierung bestimmt, wobei isotopenmarkierte interne Standards zur Korrektur technischer Abweichungen verwendet und das Ergebnis anschließend anhand einer Kalibrierungskurve bekannter Konzentrationen von Standardmischungen bewertet wurden. Was die Zuordnung aller sichtbaren Peaks betrifft, gilt dies für den Fall, dass innerhalb dieses gezielten Assays sehr wenige Peaks in geringer Häufigkeit für die manuelle Zuordnung nicht sichtbar sind und daher nicht gemeldet werden. Die Metabolitenwerte (μmol) wurden auf das Trocken-/lyophilisierte Stuhlgewicht (g) normalisiert und analysiert anhand des Verhältnisses (μmol/g). Alle Metabolitenkonzentrationen sowohl für die NMR- als auch die LC-MS/MS-Analyse wurden von TMIC sowie deren Nachweisgrenze (LOD) aufgezeichnet.

Alle 31 Metaboliten aus der NMR-Analyse wurden für die nachfolgende Analyse aufbewahrt. Von den 590 Metaboliten, auf die die LC-MS/MS-Analyse abzielte, haben wir Metaboliten ausgeschlossen, die in mehr als 80 % der Proben unterhalb der Nachweisgrenze nachgewiesen wurden (was bedeutet, dass sie in weniger als 20 % unserer Proben vorhanden waren). Dies führte zum Ausschluss von 244 Metaboliten. Verbleibende Metabolitenkonzentrationen unterhalb der Nachweisgrenze (LOD) wurden mit einem Wert von der Hälfte der Mindestkonzentration für jeden Metaboliten unterstellt und logarithmisch transformiert. Anschließend wurden weitere 132 Metaboliten mit geringer Varianz basierend auf der Standardabweichung (log(SD) weniger als –5) ausgeschlossen. Es wurde bestätigt, dass für alle ausgeschlossenen Metaboliten kein signifikanter Zusammenhang mit dem Vorliegen einer 5-Jahres-Allergiediagnose besteht (Supplementary Data 4).

Ausreißer der technischen Stichprobe wurden mittels PCA-Analyse und anschließender Quantifizierung des lokalen Ausreißerfaktors (LOF) mithilfe der Pakete „stats“ bzw. „dbscan“ erkannt. Proben mit einem lof von mehr als 5 wurden ausgeschlossen (drei LC-MS-Proben und zwei NMR-Proben). Die resultierenden NMR- und LC-MS/MS-Daten wurden vor jeder nachgeschalteten Analyse einzeln mit dem „ComBat“-Paket chargenkorrigiert. Dies reduzierte den Effekt der Charge im LC-MS/MS-Datensatz von R2 = 0,11 auf R2 = 0,017 und im NMR-Datensatz den Effekt der Charge von R2 = 0,13 auf R2 = 0,004. Chargenkorrigierte Datensätze mit insgesamt 245 Metaboliten wurden für nachgelagerte Analysen zusammengeführt. Diese Vorverarbeitungsschritte wurden zur Klarheit der Datenverarbeitung und -replikation in unsere ergänzenden Codedateien (R-Datei und README) aufgenommen.

Die Datenanalyse wurde in R (Version 4.1.1) durchgeführt. Zur Vorbestimmung der Stichprobengröße wurde keine statistische Methode verwendet. Die Forscher waren während der Experimente und der Ergebnisbewertung nicht blind für die Zuteilung. Zunächst haben wir Variablen abgeleitet, die angeben, ob bei den Teilnehmern eine Erkrankung von Interesse diagnostiziert wurde oder ob sie bis zum Ende ihrer 5-Jahres-Bewertung keine Erkrankung hatten, und haben eine multivariable bedingte logistische Regression (geschichtet nach Studienzentrum) verwendet, um den Einfluss frühkindlicher und familiärer Expositionen zu bewerten , einschließlich biologischem Geschlecht, Anwesenheit älterer Geschwister, Art der Entbindung bei der Geburt, Geburtsgewicht, Geburtszeit, Stillstatus im Alter von 6 Monaten, mütterlicher Atopie, väterlicher Atopie und Exposition gegenüber NO2 in der Umwelt, bei Entwicklung einer allergischen Erkrankung durch das Alter von 5 Jahren. Fehlende Daten wurden zufällig als völlig fehlend betrachtet und Personen wurden aus der multivariablen Analyse entfernt, wenn in einer der Kovariaten ein Wert fehlte.

Das geschätzte Alter des Mikrobioms wurde aus Daten zur relativen Häufigkeit des Mikrobioms auf Artenebene unter Verwendung eines verschachtelten fünffach kreuzvalidierten Random-Forest-Regressors abgeleitet. Für die Berechnung wurde jede Messung an einer bestimmten Probe durchgeführt. Unter Verwendung der Pakete „randomForest“, „mlbench“ und „caret“ in R61,62,63 wurde ein fünffaches Zufallswaldmodell mit einem mtree-Wert von 500 verwendet, um das genaue Alter anhand der relativen Artenhäufigkeit mit mindestens 10 % Prävalenz in allen Proben. Innerhalb jeder Falte der kreuzvalidierten Analyse wurden die Hyperparameter des Random-Forest-Modells anhand eines Rastersuchraums mithilfe einer verschachtelten fünffachen Kreuzvalidierung optimiert. Das vorhergesagte Alter des Mikrobioms war die Kombination des vorhergesagten Werts jedes Holdout-Sets aus jeder kreuzvalidierten zufälligen Waldregression. Die Wichtigkeit der Merkmale war der Durchschnitt der Wichtigkeit aller Modelle im verschachtelten kreuzvalidierten Regressor.

Das Paket „phyloseq“ wurde zur Vorverarbeitung der metagenomischen Taxonomietabelle64 verwendet. Das „Maaslin2“-Paket wurde verwendet, um lineare Mixed-Effects-Modelle (MaAsLin2-Funktion)65 mit dem Standort des Studienzentrums als Zufallseffekt und einer Anpassung an die Stuhlprobe des Entnahmealters durchzuführen, um den Zusammenhang zwischen der mikrobiellen Gemeinschaftsstruktur nach 3 Monaten und 1 Jahr zu untersuchen Alter innerhalb der sechs Phänotypen im Vergleich zur Kontrollgruppe der Teilnehmer. Zu diesen Phänotypen gehörte das Vorliegen von mindestens einem von atopischer Dermatitis, Asthma, Nahrungsmittelallergie oder allergischer Rhinitis, das Vorliegen von mindestens zwei von atopischer Dermatitis, Asthma, Nahrungsmittelallergie oder allergischer Rhinitis und das Vorliegen von atopischer Dermatitis, Asthma, Nahrungsmittelallergie oder allergischer Rhinitis individuell. Insbesondere wurden die Vergleiche jeder Gruppe mit Teilnehmern, bei denen festgestellt wurde, dass sie bis zum Ende ihrer 5-Jahres-Bewertung keine allergischen Erkrankungen hatten, unabhängig voneinander durchgeführt.

Die Artenvielfalt, gemessen als Shannon-Index, wurde mit dem Paket „vegan“ berechnet. Um Bakterienarten und MetaCyc-Signalwege zu identifizieren, die signifikant mit jedem Phänotyp assoziiert sind, wurde dasselbe Modell auf die logarithmisch transformierte relative Häufigkeit von Arten und MetaCyc-Signalwegen angewendet. Modelle wurden nur auf Arten angewendet und MetaCyc-Pfade, die in mindestens 10 % der verwendeten Proben nachgewiesen wurden, wurden getestet (72 Arten bzw. 347 Pfade), die Standardeinstellung im MaAsLin2-Paket. MaAsLin2 fügt eine Pseudozählung der Hälfte des minimalen Arten- oder MetaCyc-Signalwegniveaus hinzu, das vor der logarithmischen Transformation der relativen Häufigkeiten erkannt wurde. P-Werte wurden mithilfe des Benjamini-Hochberg-Ansatzes korrigiert und Ergebnisse mit FDR <0,1 wurden als signifikant angesehen und entsprechend dargestellt.

Für alle metabolomischen Profilanalysen wurden vor den Analysen Chargenkorrekturen durchgeführt. Die Permutational Multivariate Variance Analysis (PERMANOVA)-Analyse wurde angewendet, um den Zusammenhang zwischen dem von Säuglingsmikrobiota abgeleiteten vorhergesagten Alter und dem Metabolom unter Verwendung des R-Pakets „vegan“66 zu quantifizieren. Als Maß für den Vergleich zwischen dem vorhergesagten Alter mit Anpassung an das genaue Alter der Probenentnahme und der Verarbeitungszeit zwischen Stuhlentnahme und Langzeitlagerung sowie der Entnahmestelle als Schicht wurde der euklidische Abstand verwendet. Spearman-Korrelationsanalysen wurden mit dem Paket „RcmdrMisc“ durchgeführt und unter Verwendung von r- und Benjamini-Hochberg-korrigierten p-Werten67 berichtet.

Die Häufigkeit von Mekoniummetaboliten wurde logarithmisch transformiert und anschließend wurde eine gewichtete Genkoexpressionsnetzwerkanalyse (WGCNA) unter Verwendung des „WGCNA“-Pakets in R68 durchgeführt. Basierend auf dem skalenfreien Topologie-Anpassungsindex wurde ein Soft-Power-Schwellenwert von 4 ausgewählt. Positiv korrelierte Metaboliten wurden mithilfe von „signed hybrid“-Netzwerken und Biweight-Mittelkorrelation gruppiert. Die minimale Modulgröße wurde auf fünf Metaboliten festgelegt und Module, die bei 0,85 oder mehr miteinander korrelierten, wurden zusammengeführt. Daraus entstanden 14 Module. Skalierte durchschnittliche Expressionswerte aus der WGCNA-Ausgabe wurden mit skalierten Häufigkeiten der 50 nicht geclusterten Metaboliten kombiniert.

Um den Vermittlungseffekt fehlregulierter Signalwege und Metaboliten für die Darmreife bei allergischen Erkrankungen zu bewerten, verwendeten wir Strukturgleichungsmodellierung (SEM) unter Verwendung des R-Pakets „lavaan“69. Zur Modellspezifikation haben wir zunächst die 1-Jahres-Darmmikrobiom-unausgeglichenen Pfade und Metaboliten (dh latente Variable) mithilfe einer Faktoranalyse konzeptualisiert. Die latente Variable wurde als eine Kombination von Signalwegen definiert, die signifikant mit mindestens zwei der Allergiediagnosen assoziiert sind, und einer der zusammengesetzten Gruppen und Metaboliten, die mit einem hohen Anteil derselben Signalwege assoziiert sind. Anschließend haben wir gleichzeitig den Mediationseffekt (indirekter Effekt) fehlregulierter Signalwege und Metaboliten abgeschätzt, indem wir zwei multiple Regressionen an latente Variablen und Ergebnisvariablen angepasst haben, unter der Annahme, dass die Fehlerterme beider Regressionen nicht korrelieren. Alle Modelle wurden an das Studienzentrum, das Alter der Stuhlprobenentnahme und die Verarbeitungszeit zwischen Stuhlentnahme und Langzeitlagerung angepasst.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Teilnehmerdaten waren zum Schutz der KINDER-Teilnehmer unter eingeschränktem Zugriff verfügbar. Der Zugriff kann durch Kontaktaufnahme mit Stuart E. Turvey ([email protected]) erfolgen. Die in dieser Studie verwendeten Schrotflinten-Metagenomdaten sind in der NCBI-Datenbank unter dem BioProject-Zugangscode PRJNA838575 verfügbar. Die in dieser Studie verwendeten Stoffwechselprofildaten sind in der MetaboLights-Datenbank unter dem Zugangscode MTBLS7919 verfügbar. Für zusätzliche klinische Daten und Stuhldaten der Teilnehmer richten Sie bitte weitere Anfragen nach Ressourcen und Reagenzien an Stuart E. Turvey ([email protected]) und werden von diesem bearbeitet.

Der Code für die Studie ist in den Zusatzdateien enthalten.

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Wir danken allen Familien, die an dieser Studie teilgenommen haben, und dem CHILD-Team, einschließlich Interviewern, Krankenschwestern, Computer- und Labortechnikern, Büroangestellten, Wissenschaftlern, Freiwilligen, Managern und Rezeptionisten. Die Canadian Institutes of Health Research (CIHR), Debbie und Don Morrison und das Allergy, Genes, and Environment Network of Centres of Excellence (AllerGen NCE) leisteten wesentliche Unterstützung bei der Einrichtung der CHILD-Studie (Zuschüsse an den Gründungsdirektor von CHILD, MS, und den derzeitigen Direktor, PS). ). SET hat einen kanadischen Tier-1-Forschungslehrstuhl für pädiatrische Präzisionsgesundheit und einen Aubrey J. Tingle-Professor für pädiatrische Immunologie inne. CH wird durch das John Richard Turner Fellowship in Microbiology der University of British Columbia, den PhD Award der President's Academic Excellence Initiative und das Four Year Doctoral Fellowship (4YF) der University of British Columbia finanziert. DLYD wird vom Canadian Institute of Health Research Frederick Banting and Charles Best Canada Graduate Scholarship Doctoral Award (CIHR CGS-D) und der University of British Columbia 4YF finanziert. MBA hat einen kanadischen Tier-2-Forschungslehrstuhl für die Entwicklungsursprünge chronischer Krankheiten inne und ist Fellow des CIFAR Humans and the Microbiome Program. Zusätzliche Mittel wurden von CIHR, AllerGen NCE, Genome Canada und Genome British Columbia ([274CHI]) SET, [FDN-159935] BBF und [EC1-144621] SET bereitgestellt. PS hat einen erstklassigen kanadischen Forschungslehrstuhl für pädiatrisches Asthma und Lungengesundheit inne. Wir bedanken uns außerdem für die Unterstützung des BC Children's Hospital Research Institute and Foundation und der Provincial Health Services Authority.

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Charisse Petersen, Stuart E. Turvey.

Abteilung für Pädiatrie, BC Children's Hospital, University of British Columbia, Vancouver, BC, Kanada

Courtney Hoskinson, Darlene LY Dai, Kate L. Del Bel, Charisse Petersen und Stuart E. Turvey

Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie, University of British Columbia, Vancouver, BC, Kanada

Courtney Hoskinson & B. Brett Finlay

Abteilung für Pädiatrie und Kindergesundheit, University of Manitoba, Winnipeg, MB, Kanada

Allan B. Becker, Elinor Simons und Meghan B. Azad

Abteilung für Pädiatrie, Krankenhaus für kranke Kinder, Toronto, ON, Kanada

Theo J. Moraes & Padmaja Subbarao

Abteilung für Pädiatrie, University of Alberta, Edmonton, AB, Kanada

Piushkumar J. Mandhane und Anita L. Kozyrskyj

Michael Smith Laboratories, University of British Columbia, Vancouver, BC, Kanada

B. Brett Finlay

Abteilung für Biochemie und Molekularbiologie, University of British Columbia, Vancouver, BC, Kanada

B. Brett Finlay

Abteilung für Lebensmittel- und Humanernährungswissenschaften, University of Manitoba, Winnipeg, MB, Kanada

Meghan B. Azad

Manitoba Interdisciplinary Lactation Center (MILC), Forschungsinstitut für Kinderkrankenhäuser von Manitoba, Winnipeg, MB, Kanada

Meghan B. Azad

Medizinische Fakultät, McMaster University, Hamilton, ON, Kanada

Padmaja Subbarao

Dalla Lana School of Public Health, University of Toronto, Toronto, ON, Kanada

Padmaja Subbarao

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Konzeptualisierung, CH, DLYD, CP und SET; Methodik, CH, DLYD und CP; Untersuchung und formale epidemiologische, metagenomische und metabolomische Analyse, CH, DLYD und CP; Visualisierung, CH und CP; Finanzierungseinwerbung, SET; Ressourcen, MBA, BBF, PS und SET Datenüberwachung – Statistische Analysen, CH, DLYD und CP; Uneingeschränkter Zugriff auf alle Daten, CH, DLYD, CP und SET; Erster Entwurf, CH, DLYD, CP und SET; Überprüfung und Bearbeitung, CH, DLYD, ABB, TJM, PJM, BBF, ES, ALK, PS, MBA, CP und SET. Alle Autoren stimmten der Einreichung des Manuskripts zu, lasen und genehmigten den endgültigen Entwurf und übernehmen die volle Verantwortung für dessen Inhalt. einschließlich der Genauigkeit der Daten und ihrer statistischen Analyse.

Korrespondenz mit Stuart E. Turvey.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Pamela Ferretti und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Hoskinson, C., Dai, DLY, Del Bel, KL et al. Eine verzögerte Reifung der Darmmikrobiota im ersten Lebensjahr ist ein Kennzeichen pädiatrischer allergischer Erkrankungen. Nat Commun 14, 4785 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40336-4

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Eingegangen: 23. Februar 2023

Angenommen: 19. Juli 2023

Veröffentlicht: 29. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40336-4

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